产品介绍
慢病毒(Lentivirus)载体是在HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)基础上发展的基 因治疗载体，可以将外源基因稳定、有效整合到宿主染色体上，并且持久表达，产 生的免疫反应小。 p24蛋白含量代表着慢病毒的颗粒数，因此通过ELISA检测p24蛋白含量是 常用的慢病毒物理滴度检测方法。通常情况下，从细胞中收获的慢病毒上清液中 含有大量游离p24蛋白，其对ELISA检测结果造成很大误差。传统的慢病毒ELISA 试剂盒检测的是总p24水平（慢病毒包被p24和游离p24），其不能用于精确测定 慢病毒上清样本中的病毒颗粒数。 艾策生物的慢病毒ELISA检测试剂盒（磁珠法）（AC72837）用于定量检测慢 病毒相关的HIV-1 p24核心蛋白，先采用磁珠去除样本中游离p24干扰，再用 ELISA方法精确定量慢病毒相关的p24蛋白。

检测原理
慢病毒滴度检测ELISA试剂盒（磁珠法）的检测原理是基于磁珠法和“三明 治”夹心ELISA法。首先，慢病毒上清样本中游离的p24通过磁珠法进行去除，将去 除游离p24的慢病毒裂解样本添加至捕获板上，p24蛋白可以被包被在捕获板上 的抗p24重组抗体捕获。捕获的p24蛋白与另一个生物素偶联的抗p24重组抗体 结合。加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(Streptavidin-HRP)，与生物素偶 联的抗p24重组抗体发生反应。加入显色液，最后加入终止溶液终止反应，整体颜 色强度与特异性结合的p24蛋白含量成正相关。用酶标仪在450 nm处测量吸光 度（可选：在650 nm处的参考波长）。根据p34蛋白标准曲线对病毒裂解液样品中 p24含量进行精确定量，最后通过p24含量推算出慢病毒的滴度。

Capture Plate： 96孔微孔板（8孔×12条），板内配置12条，板用干燥剂密封在 铝箔袋中。
p24 Control / Biotinylated Anti- p24 Antibody：使用前用1×样品稀释缓冲 液溶解重新配制，溶解后的试剂在2℃-8°C保存长达2周，若要长期储存，请在 -20°C或以下的条件中储存，避免反复冻融。

试剂盒未提供的材料与设备
（1）能够检测450 nm吸光度的酶标仪，参考波长640 nm
（2）涡旋振荡器、微孔板振荡器
（3）离心机
（4）移液器、枪头、加样槽等
（5）准备试剂用的试管、离心管、量筒等
（6）去离子水或蒸馏水
（7）吸水纸
（8）计时器
（9）PBS

储存条件及有效期
检测试剂盒2°C-8°C保存，有效期12个月；开封后，有效期1个月。

（1）所有的化学试剂理应被认为具有潜在危害，请按照当地规定进行处理。
（2）所有使用本试剂盒的人员必须完成适当的生物安全培训，操作时请佩戴合适 的防护设施，例如白大衣、乳胶手套、安全眼镜等。
（3）请避免试剂接触皮肤和眼睛，如不慎接触，请立即用大量清水清洗。
（4）试剂盒中的终止液为酸性溶液，在使用终止液时，请佩戴防护服，及防护眼 镜、手及面部的设施。
（5）本试剂盒仅用于科学研究，不得用于其它用途。
（6）如果包装或内容有任何可见损坏，不要使用套件。
（7）为保证测试的准确性，请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒 中的试剂。
（8）请不要使用超过规定效期的试剂。
（9）在试剂盒的贮存或孵育过程中请避免强光照射。
（10）试剂的准备必须使用蒸馏水或去离子水。
（11）为了避免微生物的污染，以及试剂与样本间的交叉污染，请使用一次性枪头。
（12）浓缩洗液在4°C时会有结晶析出属于正常现象，恢复室温后混匀即可使用。
（13）检测前，所有试剂必须平衡至室温（20°C-25°C）。一次只取适量的试剂，不要 将未使用过的试剂放回小瓶中，避免发生试剂污染。
（14）实验过程中，不要让孔板长时间处于干燥状态，清洗步骤完成后立即进行下一步。

试剂配制
检测前，请将所有的试剂、样本平衡到室温（20°C-25°C），使用后立即放回冰 箱。若浓缩的试剂出现结晶，37°C水浴，直至结晶完全溶解。 
● 1×清洗液
用去离子水或蒸馏水稀释20×清洗液至1×清洗液，备用。
●1×样品稀释缓冲液
用去离子水或蒸馏水稀释5×样品稀释缓冲液至1×样品稀释缓冲液，备用。
● Biotinylated Anti-p24 Antibody
用250 μL的1×样品稀释缓冲液溶解Biotinylated Anti-p24 Antibody，室温下放置5 min，根据标准品和待检样本的数量，用1×样品稀释缓冲液按1:50稀 释Biotinylated Anti-p24 Antibody。
● Streptavidin-HRP
根据标准品和待检样本的数量，用1×样品稀释缓冲液按 1:1000稀释浓缩 的Streptavidin-HRP。
● 标准品配制 用1.25 mL的1×样品稀释缓冲液溶解p24 Control，室温下放置5 min，根据标准品的数量，用1×样品稀释缓冲液按 1:100稀释p24Control，确保充分混匀，再从中取60 μL加入540 μL 的1×样品稀释缓冲液，此p24稀释液浓度为800 pg/mL， 记为ST-1。再取300 μL ST-1加入300 μL的1×样品稀释缓冲液混匀，记为ST-2，以 此类推，稀释至ST-7。以1×样品稀释缓冲液作为标准曲线的零浓度。

● 慢病毒样品预处理
将未知样品用1×PBS稀释，使样品中游离p24含量在500 ng/mL以内（建议 搭配使用艾策生物慢病毒快速检测试纸（Cat#AC72843），初步判定游离p24的浓 度），加入50 μL p24 Binding Reagent ，涡旋混匀后旋转孵育30 min（建议反应体系为0.5 mL-1.0 mL）。将EP管置于磁力架静置2 min，取150 μL上清加入150 μL  Lysing Buffer，混匀反应3 min,将混合液稀释1000倍以制得检测用样品。建议所 有样品都准备一式两份。将结果乘以稀释系数，确定原始样品中的p24浓度值以 计算慢病毒滴度。
注：用于结合游离p24的磁珠可重复利用2-4次（具体根据实际情况而定），推荐用 0.5 mL Glycine-HCl缓冲液（50mM pH 2.5）重悬洗涤磁珠3-5次，每次吹打洗涤 后静置1 min。洗涤后的磁珠可短期保存于10mM PBS中，若需长期保存，建议将 磁珠置于磁珠保存液（10mM PBS，0.1%BSA，2mM EDTA）中4℃保存。

ELISA操作流程
（1）按试剂配制步骤制备好p24标准品和样品。将不需要的板条拆卸下来，放回铝箔袋中重新封好封口。 
（2）标准品与样品孵育：在相应孔中加入100 μL的待测样品、标曲样品（ST-1~ST-8）， 用封板膜覆盖平板，在37°C下孵育60 min。
（3）洗板：取下封板膜，弃掉孔板中液体，每孔加入250 μL的1×清洗液，充分洗涤 4次，每次浸泡30 s，在清洗步骤后将倒置的平板放在吸水纸上拍干，为了保证理 想的实验性能，需尽量去除残留液体。
（4）生物素标记抗体孵育：在所有检测孔中加入100 μL稀释的Biotinylated  Anti-p24 Antibody（参见试剂配制），封板膜封板，在37°C下孵育60 min。
（5）洗板：重复步骤（3）。
（6）酶偶联链霉亲和素孵育：在所有检测孔中加入100 μL的Streptavidin-HRP （参见试剂配制），封板膜封板，过程避光，在37°C下避光孵育60min。
（7）洗板：重复步骤（3）。
（8）显色：每孔加入100 μL显色液，轻轻振荡混匀，避光，室温孵育15 min（在第一 孔加入显色液后开始计时）。 （9）检测：每孔加入100 μL终止液，轻轻振荡混匀，立即使用酶标仪进行双波长检 测，测定450 nm最大吸收波长和650 nm参考波长下的OD值。校准后的OD值为450 nm的测定值减去650 nm的测定值。仅使用450 nm测定会导致OD值偏高， 并且准确度降低。

数据处理
1. 制作标准曲线
以p24标准品浓度（pg/mL）作为横坐标，相应的吸光度作为纵坐标，若设有 复孔，则取其平均值。利用绘图和统计学等软件，采用四参数逻辑曲线拟合程序， 通过标准曲线的各个点计算出最佳拟合的线性关系。
2. 样品p24浓度计算
将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程，计算样品p24浓度，所得的值乘以 稀释倍数，即样品的实际p24浓度（pg/mL）。该试剂盒的稀释范围是定量的，为了 获得最高的精确度，未知样品的OD值需稀释至推荐的定量范围内。
3. 样品慢病毒滴度计算
一个慢病毒颗粒（Lentiviral Particle, LP）中约有2000个p24蛋白分子，则一 个LP中p24的含量为：
2000×24×10³ /(6×10²³) g of p24=8×10^-5 pg
或者说 800 pg p24所代表的LP数目为
800pg/8×10^-5pg =1×10⁷ LPs 正常情况下，每100-1000 LPs中会有1个具有感染活性的病毒载体，即1 TU （Transducing Unit），那么80 ng/mL800 ng/mL的p24浓度对应的滴度为：
80 ng/mL-800 ng/mL p24 = 1×10^9-10 LPs/mL ≈ 1 ×10⁷ TU/mL

产品数据展示
1. 标曲数据
数据拟合绘制标准曲线，生成的标准曲线用于实验数据分析。

2. 线性范围
试剂盒的线性范围为12.5pg/mL-800 pg/mL。
3. 加样回收率 使用试剂盒，在Expi293F细胞上清中检测三个不同p24浓度分析样本的加样 回收率，结果显示加样回收率均在80%-120%之间，表明Expi293F细胞上清并不 影响慢病毒滴度的检测。

4 精密度 使用试剂盒，分别对p24高、中、低3个浓度的样本进行测试，每个样本重复检 测10次，每个样本计算10次测量浓度结果的平均值，计算变异系数(CV)。根据性 能评估结果，所测结果CV（%）均低于10%，表明试剂盒精密度良好。